细胞实验protocol（求稳定细胞株筛选的protocol，求助各位大神）
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求稳定细胞株筛选的protocol，求助各位大神
稳定细胞株筛选是一个长期的过程，稳定细胞株筛选优化，有许多条件需要摸索，而且是从源头开始
① 在构建载体时，目的基因直接整合到细胞染色体组上，最好不要通过先瞬转在筛选稳定细胞株的这种方法，因为转染效率没有保证
② 高表达载体的构建，哺乳动物表达量一直是它自身的缺点，最好根据高表达载体定向的驯化细胞，提高蛋白表达量
③ 细胞的选择，筛选稳定细胞株我们常用的细胞是CHO，中国仓鼠卵巢细胞，由于CHO具有诸多的优点因此适合用于筛选稳定细胞株，而HEK293细胞则常用于瞬时转染
④ 后期的筛选，双抗预防污染，筛选细胞的时候抗生素浓度一定要做预实验，而且转染的时候不能有抗生素，关于细胞转染 稳定细胞系构建的相关理论
细胞冻存的操作步骤
细胞冻存
1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清,4℃冰箱保存预冷；
2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基,PBS冲洗两次,用胰酶消化细胞（尽可能温和）；
3.再次用完全培养液悬浮细胞,将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中,用滴管轻轻吹打混匀.
4.在每支冻存管中加入1ml细胞液,密封后标记冻存细胞名称和冻存日期.
5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力,如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜,放入液氮罐）最好；或者可以在4℃,2h；然后转到-20℃,2h；-80℃,2h；放入液氮罐.
这是我实验中用的protocol,,10,今天看师兄做的，跟上面那位说的好像有点出入：在加入胰酶消化，然后补充培养基后，师兄先是离心，然后去上清，然后冻存液重悬沉淀，没有再加培养基，然后4度30min，在-70度冷冻过夜,1,
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