生物学常用的protocol（细胞生物学：小鼠胚胎干细胞培养实验步骤）
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细胞生物学：小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。
1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞
明胶包被
细胞传代
2 、体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
体外分化方法
注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养——维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基
ES：
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基——见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液
DMEM（高糖）
马血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST
LIF
复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：
1.从液氮中取出一管细胞；
2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3.将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4.加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5.离心3分钟；
6.弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7.接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8.孵育。
ATMT protocol
⑴ 转化受体可以是多种类型
ATMT转化的受体材料可以是多种类型的, 既可以用原生质体, 也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体。
⑵ 转化效率高
同传统的真菌转化方法, 如PEG-CaCl2法相比, ATMT方法的转化效率有明显提高。
⑶ 单拷贝的随机插入
ATMT的非同源转化, 大部分转化子为单拷贝的T-DNA插入。
⑷ 转化子稳定
M.purpureus的ATMA转化子经过四轮孢子培养及筛选过程后, 98%的克隆仍然表现出对潮霉素的抗性。
⑴ 双元载体的构建及工程菌株的制备
将具有合适真菌启动子的筛选标记基因插入到T-DNA的左边界和右边界之间, 然后把构建好的双元载体 (binary vector) 通过冻融法等方法导入A.tumefaciens中。
⑵ 工程菌株的培养与处理
接种含双元载体的根癌农杆菌工程菌株到含有合适抗生素的MM (minimal medium) 培养液 (Casas-Flores et al., 2004) 中, 28℃, 200r/min培养1-2d。
⑶ 共培养及转化子的筛选、鉴定
将上述 A.tumefaciens 菌液与等体积的真菌分生孢子悬浮液混合, 把混合液涂布在铺有玻璃纸固体IM培养基上, 在适宜的温度 (通常为28℃) 下共培养2-3d后, 将玻璃纸转移至适于真菌生长的固体培养基上, 于适宜温度下 培养数天 (4-5d) , 直至出现抗性菌落。
⑴ 根癌农杆菌（EHA105）的转化OD值
根癌农杆菌介导的高效转化需要合适的农杆菌浓度，即需要与真菌的孢子数目保持一定的比例关系。农杆菌浓度太小则相对于单个真菌孢子而言达不到转化所需要的浓度，浓度过大则可能会抑制孢子的生长,导致转化失败或者转化效率太低。
⑵ 乙酰丁香酮(acetosyingone, As)的浓度
共培养基中As能起到诱导活化农杆菌vir基因的作用，浓度太低会导致农杆菌病毒蛋白表达量不够，难以完成转化，AS浓度过大可能会导致T-DNA插入的拷贝数目增加。
⑶ 菌体浓度对转化效率的影响
转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。但其最高使用浓度有一定的界限, 当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子, 使转化效率降低。
⑷ 选择标记
以潮霉素磷酸转移酶 (hygromycin B phosphotransferase, hph) 基因作为选择标记基因。
⑸ 共培养时间对转化效率的影响
共培养时间的长短关系到农杆菌vir基因的表达及其蛋白的活化以及T-DNA的剪切和复合物向孢子内的转移,过短的共培养时间将导致转化无法顺利完成.但是共培养时间太长,非转化子对转化子生长的竞争作用将导致转化效率降低,加大假阳性出现的概率。
⑹ 共培养温度对转化效率的影响
共培养温度也是影响转化效率的重要因素, 已有研究发现22~25℃是最适的转化温度。
Reference：
.生物技术通报,2007(03):111-114.
.菌物学报,2005(04):142-149.
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